线粒体脱氧核糖核酸缺失综合征(MDS)是一种严重的、表型异质的隐性遗传病，表现为组织和器官中mtDNA（线粒体DNA)含量显著降低。脱氧核糖核苷激酶(DGUOK)基因突变是肝脑型MDS的主要病因。绝大多数DGUOK突变型MDS患者因为严重的肝功能衰竭,会在2岁前死亡。然而，铁超负荷和肝损伤的病理机制仍然未被研究透彻，同时寻找肝脑型MDS的有效治疗靶点已刻不容缓。
鉴于此，中科院广州生物医药与健康研究所的刘兴国研究员团队基于诱导多能干细胞和基因编辑技术，设计了一种衍生肝细胞类器官模型来考察肝脑型MDS的病理机制。
研究者将两名患者的皮肤成纤维细胞重新编程为诱导多能干细胞(iPSCs)，通过CRISPR/Cas9校正了基因突变。为了纠正突变的DGUOK基因，设计的gRNA分别靶向P1（病人1，女）的外显子6和P2（病人2，男）的内含子1。然后将cas9质粒和单链寡脱氧核苷酸(ssODNs)转染到P1和P2iPSCs中。挑选单克隆，经PCR扩增和测序验证，获得了两名患者的DGUOK突变校正克隆。基因编辑后校正的iPSCs的染色体组型(karyotype)正常。接着将患者来源iPSCs和校正后iPSCs诱导再分化为肝细胞样细胞(iHep)，并以此为基础构建肝细胞类器官(iHep-Orgs)模型。
图1
患者来源以及基因矫正后的iPSCs诱导的肝细胞和类器官模型
研究者对iHep-Orgs的功能进行了表征。肝细胞生物标志物染色及肝功能测定的结果表明，三维培养的iHep-Orgs与二维培养的iHep相比，具有更为成熟的肝样特征。
图2
iHep-Orgs的功能表征
然后，研究者评估了患者iHep的线粒体DNA耗竭和呼吸功能障碍的情况。研究发现，患者iHep中mtDNA拷贝数和表达水平下降，但线粒体数量并未下降。此外，iHep患者的基础氧消耗量和ATP产生减少，呼吸链复合物活性降低。这些结果表明，患者iHep的线粒体呼吸活动受损。
图3
患者iHep的线粒体DNA耗竭和呼吸功能障碍
随后，研究者为了探讨DGUOK突变型MDS铁超载和致死性肝衰竭的病理机制，采用柠檬酸铁铵(FAC)来诱导铁超载。结果患者iHep-Orgs和iHep对铁超载诱导的细胞死亡更敏感。而铁死亡抑制剂DFO（去铁胺）和Fer-1能够逆转这种细胞死亡，说明肝衰竭是由铁超载所引发的肝细胞铁死亡所导致的。
图4
iHep-Orgs和iHep对铁超载诱导的敏感性
其后作者设计实验确定了细胞内超载的游离铁来源于转铁蛋白在溶酶体中的降解，并且自噬标志物NCOA4（核受体共激活因子4）在这一过程中扮演了关键角色。
图5
mtDNA缺失综合征的铁死亡机制
总之，作者探究了DGUOK基因突变患者铁死亡的病理机制，揭示了线粒体DNA缺失与铁死亡之间的联系。本研究结果为发现MDS患者肝功能衰新的治疗途径奠定了有力基础。
参考文献：JingyiGuo,LifanDuan,XueyingHe,ShengbiaoLi,YiWu,GeXiang,FeixiangBao,LiangYang,HongyanShi,MiGao,LingjunZheng,HuiliHu,andXingguoLiu.ACombinedModelofHumaniPSC-DerivedLiverOrganoidsandHepatocytesRevealsFerroptosisinDGUOKMutantmtDNADepletionSyndrome.Adv.Sci.,8,.
DOI:10./advs.20
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