点评
惠利健（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心）
#肿瘤#
以糖尿病足溃疡为代表的难愈合皮肤创伤，可造成较高的截肢和死亡率，但缺乏针对性治疗手段。这类创面难愈合的一个重要机制，是创面组织局部中的单核/巨噬细胞的表型转变受阻。在普通皮肤组织从创伤到愈合的过程中，从循环系统迁入的单核细胞发生高度动态的表型和功能转化，通过在不同阶段释放不同组合又种类多样的细胞因子和生长因子，精确调控炎症状态，促进血管生长和细胞增殖分化。然而，在糖尿病创面，因为复杂的病理机制，单核/巨噬细胞的表型动态转变受阻，造成局部免疫微环境紊乱。而且，实践证明，简单地通过递送“促炎”或“抑炎”类细胞或药物，均无法重塑这一精确动态的调控过程，不能发挥理想的组织修复治疗效果。
澳门大学王春明与南京大学董磊联合团队提出全新猜想：借鉴肿瘤发展过程中，肿瘤相关巨噬细胞（Tumour-associatedmacrophages;TAMs）帮助肿瘤组织塑造免疫抑制、促进肿瘤细胞生长迁移、诱导肿瘤血管新生的复合功能，将“魔鬼”的力量用于治疗性应用。相关研究成果近日以Tumor-associatedmacrophages-educatedreparativemacrophagespromotediabeticwoundhealing为标题，发表在EMBOMolecularMedicine杂志。
他们进一步分析，对于糖尿病难愈合创面，局部免疫功能紊乱，可采用细胞治疗的手段移植新的、具有以下复合功能的巨噬细胞：1）具备适当的抑炎表型，平衡局部免疫微环境；2）具备精确的调控活性，可诱导已存于创面的免疫细胞和实质细胞发挥修复功能，尤其抑制第二波Ly6C+单核细胞浸入；3）具备丰富的修复功能，可大量分泌各种促进血管新生、细胞外基质及皮肤附属器官再生的细胞因子。如此“要求苛刻”的活性特点，在体外存在的各类M1/M2亚型等常规表型难以满足，但却与肿瘤发展过程中TAMs的常规功能高度契合！然而，肿瘤来源的TAMs不仅存在明显的安全问题而不能直接用于细胞治疗，更是从理论上无法满足自体单核细胞驯化和移植的可能性（因为糖尿病足患者不可能都同时罹患肿瘤）。
团队进一步大胆猜想，TAMs可以通过旁分泌作用将其修复特性完全或部分地传递给非极化巨噬细胞，从而可以用普通的单核/巨噬细胞（未来临床可用病患自体单核细胞），作为细胞治疗的来源（图1）。此猜测亦是基于TAMs通过自分泌多种细胞因子（如IL-10，VEGF）维持自身免疫抑制表型、及通过旁分泌（如IL-10，TGF-β）影响其他巨噬细胞和其他免疫细胞转化为免疫抑制和促血管新生的表型，从而维持肿瘤微环境的机制。为了验证这一猜想，基于该团队前期对于不同肿瘤匀浆液的生物活性比较分析（ScienceAdvances;），他们从小鼠肉瘤（S）模型中分选出TAMs，培养15天后收取培养上清，用此上清培养小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）2天，得到TAMs驯化的巨噬细胞（TAMs-educatedmacrophages;TAMEMs），并将其同时与BMDMs诱导而来的、传统上作为体外培养极化代表的M1和M2型巨噬细胞作为对照，通过一系列细胞和分子生物学实验进行了比较。
图1.研究团队尝试将TAMs帮助肿瘤发展的活性用于促进组织修复
结果非常有趣。首先，研究者证实了TAMEMs可再现TAMs的修复特征，高表达血管生成因子和免疫抑制细胞因子。更有趣的是，单细胞测序结果表明，TAMEMs具有完全不同于经典M1/M2的表型（图2）。例如，TAMEMs不能以传统的极化标志基因（Cd86和Mrc1）来定义，而是具有更加丰富的异质性，其表达的两个特异性标志基因（Gas6和Spp1），与爱丁堡大学Qian等在TrendsinImmunology中总结的Spp1+巨噬细胞参与炎症调节和血管生成保持一致（CancerDiscovery,.NatureNeuroscience,）。其次，TAMEMs与TAMs具有相似的转录组表达谱，且通过基因集变异分析（GSVA）发现，与TAMs相似，TAMEMs高表达的基因主要富集在促进组织修复和免疫抑制的GOterm中（例如，GO：extracellularmatrixorganization;GO:positiveregulationbloodvesselbranching;GO:negativeregulationofinterleukin-1betaproduction），与研究者的猜想吻合。但另一方面，TAMEMs中的基因并没有富集在TAMs参与的肿瘤代谢相关GOterm中（例如，GO:glycolyticprocess;GO:regulationofglucoseimport）。体外实验发现，TAMEMs在塑造免疫抑制微环境、促进血管新生和激活成纤维细胞等方面都优于其他对照巨噬细胞。
图2.单细胞测序等手段揭示TAMEMs不同于经典体外极化模型的表型
为考察这一方法作为细胞治疗的转化潜力，团队将TAMEMs（或对照细胞）载入由明胶（美国FDA批准生物材料）制成的静电纺丝支架中，递送到药物诱导的I型、和转基因诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠皮肤创面中，显示TAMEMs可以最优的效果促进创面愈合。第一，TAMEMs可快速激活成纤维细胞，从而促进新生肉芽组织的形成，即使相比起传统意义上被认为抑炎和促进修复的M2亚型相比，更加迅速地抑制糖尿病伤口的炎性环境，抑制Ly6C+炎性单核细胞的浸润；第二，TAMEMs不仅可以促进血管新生，更是所有测试组中唯一恢复血管正常排布的，其排布模式与未受伤皮肤血管排布相似，表现出TAMEMs对血管新生和成熟的精准调控；此外，TAMEMs也促进了皮肤组织中Col1a1，Tgfb1，Vegfa和Pdgfb的表达。以上研究表明，TAMEMs在I/Ⅱ型糖尿病小鼠伤口模型中有效、全面促进糖尿病创面的修复，且优于其他巨噬细胞表型。
尽管TAMEMs来源于正常组织而非肿瘤，但为了进一步提高这一策略的安全性，研究者考察是否可以抛弃来自肿瘤的“教官”——TAMs，从而在全过程中不使用任何肿瘤来源成分。通过分析鉴定TAMs培养液的组分，选定了9种分泌型细胞因子（Osteopontin，IL-10，VEGF-B等）组成重组蛋白“鸡尾酒”来代替TAMs的使用（图3.A）。用重组蛋白鸡尾酒诱导BMDMs得到TAMEMsC与TAMEMs高度相似（皮尔森系数为0.98），具有免疫抑制和激活基质细胞的能力，并使用该鸡尾酒驯化人来源的单核细胞并移植入免疫缺陷小鼠的糖尿病伤口模型，进一步验证了TAMEMsC改善糖尿病伤口难愈合的情况（图3.B）。
图3.研究者筛选出重组蛋白鸡尾酒替代肿瘤来源的TAMs，并诱导出人单核细胞来源的TAMEMsC用于促进糖尿病小鼠创面愈合情况.(A)蛋白芯片技术从种蛋白筛选出9种组成重组蛋白鸡尾酒。(B)TAMEMsC在免疫缺陷糖尿病小鼠皮肤损伤21天后重塑血管网络，接近未受伤完整皮肤的血管网络。
该研究首次揭示，可将TAMs的促肿瘤发展的能力转变为一种促进修复的特性，并通过简单的方式传递给非肿瘤来源的单核细胞。研究者最后证明可抛弃肿瘤来源的物质，开发更加有效、精确、安全的细胞治疗，以发挥更高的临床转化潜力。研究团队已通过澳门大学申请中国与美国发明专利，并通过澳门大学孵化的科技企业开展转化工作。
专家点评
惠利健（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员）
细胞治疗作为新的治疗手段，给很多用小分子或者生物大分子难治的疾病提供了新的可能性，比如说退行性神经疾病，肝衰竭，脆性糖尿病等等。细胞治疗承载了很多的希望，但其进展，仍然要基于对疾病本身的理解，基于对细胞作为药物，其作用机制（MOA）的理解。王春明团队和董磊团队合作的研究，给出了一个很好的例子。
糖尿病伴随的不可愈合的溃疡，由于没有有效治疗药物的疾病，严重时甚至导致截肢，令病人非常痛苦。当下，利用间充质细胞（mesenchymalstromalcells,也被称为间充质干细胞mesenchymalstemcells）来治疗糖尿病溃疡已经推动到了临床阶段。最近，也有报道处于实验室阶段的巨噬细胞，特别是其中的M2型（抗炎型）用于治疗糖尿病溃疡。但是M2型巨噬细胞治疗糖尿病溃疡，效果不稳定，非常可能糖尿病溃疡不是简单的炎症控制，和血管生成障碍及微环境中多种细胞的功能紊乱有关。
王春明、董磊等人现在找到一种培养获得肿瘤相关巨噬细胞（TAM）教育巨噬细胞（TAM-educatedmacrophage，TAMEM）的方法。他们研究支持TAMEM具有与传统的M1和Ｍ2巨噬细胞都很不同的特征，与TAM类似，有抗炎，促血管新生，以及组织再生的能力。在糖尿病小鼠模型给出很好的治疗效果。他们也前置考虑了未来治疗可能的需要，因此找到一种九个因子的配方，可以直接将人外周血液来源单核细胞体外诱导为类似TAMEM细胞，为推动进一步临床转化提供了基础。
这是个非常有创意的工作，把TAM的特征抓住并用到了糖尿病溃疡治疗上，希望他们能够在此基础上，更快地将这个工作带到临床。当然，在进一步带上临床前，我认为研究者们对TAMEM的特性还要进一步鉴定，包括不同个体间的差别，细胞的异质性，细胞制备过程的控制，与药效相关的biomarker的鉴定，体内的存留时间和是否可以多次用药等等。随着这些研究的深入，相信TAMEM作为细胞药物的特质将更为清晰地展示出来。
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