哈佛大学的Mooney课题组近期在AdvancedFunctionalMaterials期刊上发表了“BiomaterialsfunctionalizedwithMSCsecretedextracellularvesiclesandsolublefactorsfortissueregeneration”的文章，详细介绍了间充质干细胞（MSC）分泌的细胞外囊泡和可溶性因子的成分和作用机制，并探讨了通过生物材料来递送MSCs分泌因子的最新进展和挑战。
MSCs分泌因子
间充质干/基质细胞（MSCs）是再生医学中细胞治疗的常用细胞类型，在很多临床前和临床实验中证明了组织修复的有效性。尽管MSC具有调控组织愈合的能力，但MSC细胞注射的存留率却很低。现在，通常认为MSC主要通过旁分泌机制来发挥治疗作用。MSC分泌物可以在通过体外培养来收集MSC条件培养液（MSC-conditionedmedia，MSC-CM），其包含可溶性因子（包括细胞因子，趋化因子和生长因子）及囊泡分泌物（亦被称为细胞外囊泡（EVs））。MSC-CM可以增强体外细胞的增殖、迁移、血管生成，并具有抗凋亡和抗炎症的作用。MSC-CM已在包括皮肤伤口、帕金森病、肝衰竭、和心肌梗塞（MI）等多种临床前症状中表现出促进组织愈合的作用。
MSCs干细胞疗法受到有创性细胞提取、来源有限和生产成本高的限制，相比而言，基于MSCs分泌因子（即MSC-CM，包括可溶性因子和细胞外囊泡）的疗法具有许多潜在优势：
i)可过滤灭菌；
ii)稳定保存，无需冷冻储存，且可在解冻后直接使用；
iii)可冷冻干燥制成现成的产品，同时保留功能性。
总之，与细胞疗法相比，MSCs分泌因子疗法可有效降低生产成本。
因此，这篇综述概述了MSCs分泌的可溶性因子和EVs的成分，并综述了它们作为无细胞的再生医学策略的潜力。其中，重点介绍了由MSCs分泌因子介导的组织愈合机制，并论述了体外培养刺激对MSCs分泌因子的影响；然后，聚焦通过生物材料来递送MSCs分泌因子的最新进展；最后，探讨了EVs功能化生物材料的挑战，包括标准化、扩增性和临床转化。
MSC的组织来源
成年MSC可以来源于多种组织，如骨髓和脂肪组织。通常，新生儿组织（如脐带血和胎盘）作为无创采集的MSC来源，而皮肤成纤维细胞重编程产生的iPSC可以进一步分化为MSC。这些途径共同提供了具有治疗潜力的MSC的来源。一些证据表明，这些组织中的MSC具有血管周起源的特性。此外，还发现了器官特异性的常驻MSC，如在肺，肾和肝脏中，它们参与组织愈合，并可能应用在细胞疗法中。
MSC可以通过其塑性粘附，表面标志物（如CD44，CD73，CD90，CD）的表达以及三谱系的分化潜能等来鉴定。
图1.用于细胞治疗的MSC的组织来源。
MSCs分泌的可溶性因子和EVs
可溶性成分包括MSCs分泌的多种生长因子、趋化因子和具有免疫调节、血管生成和抗凋亡功能的激素。MSC-CM中浓度最高的可溶性因子包括血管内皮生长因子VEGF，成纤维细胞生长因子（FGF2），血管生成素-1（AGPT-1），胰岛素样生长因子（IGF-1），胎盘生长因子（PlGF），血小板衍生生长因子（PDGF），转化生长因子β（TGF-β1），白介素（IL）-6，肝细胞生长因子（HGF），和肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激的基因/蛋白质6（TSG-6）等。
EVs是指细胞分泌的，包含有脂质、蛋白质和核酸的纳米颗粒，从而充当细胞间的信使。EVs早期被认为具有细胞间通信的功能，特别是在免疫调节和癌症方面。自从研究发现EVs含有mRNA、miRNA和蛋白质，以及细胞间交换的遗传信息，相关EVs的研究正成爆炸性增长。
目前，EVs根据其生物发生过程和大小进行分类：当多囊泡胞内体与质膜融合时，释放出直径在50-nm的外泌体（exosome），而尺寸通常较大（尺寸在-0nm）的细胞微泡则是通过质膜向外出芽直接释放。最近研究发现，尺寸约为35nm的非膜纳米粒子，亦被称为外泌体；而其他囊泡被称为凋亡小体（尺寸在-nm），主要是由于程序性细胞死亡过程中，膜起泡而释放的膜结合囊泡。
在这篇综述中，使用术语EV来统称外泌体和细胞微泡，这已得到国际细胞外囊泡协会（ISEV）的认可，因为这两个子集的尺寸大小存在重叠，并且仍未就每种类型的不同表面标记达成共识。
EV分离方法包括有或没有密度梯度的超速离心（UC），尺寸排阻色谱法，基于聚合物的沉淀和免疫亲和力等方法。当将EVs根据大小分开时，发现小型和大型的EVs包含不同的蛋白质、mRNA和miRNA成分。当EVs根据其膜脂分离时，也会观察到明显不同的蛋白质和RNA。有趣的是，只有小型EVs在急性肾损伤模型中显示出治疗效果。
MSC分泌因子调控组织修复的潜在机制
MSC分泌的可溶因子和EV通过协调动员各种细胞类型、激活或触发多种细胞过程来促进组织再生。年在肾损伤模型的研究中，MSCs的治疗作用被认为归因于MSCs分泌的细胞外囊泡（EVs）。不久之后，在心肌缺血损伤的小鼠模型中，通过MSC-EVs的递送促进了心脏的再生。从那以后，从MSC-CM分离出的细胞外囊泡（EVs）已被证明可有效促进包括心血管、肌肉骨骼、神经、肾、和肺等组织/器官的修复。
受体细胞对EVs的摄取主要是通过多种内吞、微胞饮、和膜融合作用来介导的。CD81，CD63，CD9，Syntenin-1，Alix，TSG和flotillin-1是MSC和其他细胞类型分泌的EV相关蛋白质，因此通常用作EV标记物。据报道，MSC-EVs包含约种不同的蛋白质，超过个mRNA，和≈60个miRNA。
将EV的核酸、管腔和膜蛋白以及分泌的可溶性蛋白质等根据作用分为四类：抗凋亡因子、细胞迁移和增殖的促进因子、促血管生成分子以及抗炎症因子。一般，由MSC分泌因子诱导产生的这些细胞活动之间相互作用，共同实现组织愈合。
最近的重要工作已确定了EV介导促血管生成、抗凋亡和抗炎症等作用的蛋白质和核酸效应子，它们在促进组织愈合的级联反应中是不可或缺的。
许多研究者将临床前研究中观察到的EV介导的治疗作用归因于其核酸含量。有趣的是，在急性肾损伤的小鼠模型中，RNA酶（RNase）处理过的EVs不具有促进肾脏恢复的作用，暗示RNA才是其主要的治疗成分。的确如此，在急性肾脏损伤模型中，EVs的抑纤维化和促组织再生的作用是由EVs中的HGFmRNA介导的；而EVs中的miRNA（如miR-21和miR-），则可以促进骨骼肌损伤后的肌肉再生和组织愈合。另外，细胞凋亡在组织损伤中起着作用，MSC-EVs已显示出在临床前损伤模型中通过减弱细胞凋亡来促进组织再生的能力。
值得注意的是，EVs中的各种生物活性因子和MSCs分泌的可溶性因子具有多种生物效用，因此可能会引起意想不到的副作用。尽管迄今为止尚无关于副作用的报道，不同于全身递送，MSsC分泌因子的局部递送将有助于确保任何可能出现的副作用不会扩散至全身。
图2.MSC分泌因子调控组织修复的潜在机制。
MSC分泌因子的体外调控和材料修饰
调节MSC因子分泌的因素：缺氧，力学环境以及促炎症刺激可诱导MSC分泌更多、具有更高治疗效果的EV和蛋白质，还可以对MSC进行基因编辑，来上调部分能促进组织修复的RNA或蛋白质的分泌表达。
EVs可以通过多种途径进行给药，包括静脉内、腹膜内或皮下注射，并且给药途径会大大影响EVs在体内的分布。用于组织修复的最常见的EVs递送方式是直接将EVs局部注射到损伤部位。然而，这可能会导致EVs的快速流失。在某些情况下，在愈合期间EVs的反复注射是必须的。
使用生物材料递送EVs已成为一种有前景的再生医学策略，有助于提高EV的存留率和治疗效果。可以通过交联或与EV位点结合，将EV固定在生物材料中，然后作用于受损组织以诱导愈合和功能恢复。天然ECM生物材料（如胶原蛋白和透明质酸），可以分别通过整联蛋白和CD44受体与EV结合，而合成生物材料的孔隙率和降解速率则可以进行严格调节，来实现EV的可控释放。与直接注射递送相比，载EV的生物材料可以实现更高的EV留存率和更好的组织再生效果。
图3.体外培养刺激对MSCs分泌因子的影响。
图4.通过生物材料来递送MSCs分泌因子。
总结
相比于MSCs干细胞疗法，基于MSCs分泌因子的无细胞再生疗法具有许多潜在优势。MSCs分泌因子介导的体内组织修复机制主要包括免疫调节、促血管生成、抑制凋亡、和减少纤维化等。通过与EVs位点结合或将EVs包裹在基质材料中，可有效延长EVs在递送后的存留率，实现长时间的可控缓释，进而可能增强治疗效果。
参考文献
Brennan,M..,P.LayrolleandD.J.Mooney,BiomaterialsfunctionalizedwithMSCsecretedextracellularvesiclesandsolublefactorsfortissueregeneration.AdvancedFunctionalMaterials,:p..（DOI:10.2/adfm.20.）