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李强强，余晓波，周琳，等.YTHDF1单核苷酸多态性在符合杭州标准肝移植受者术后肝癌复发中的预测价值［J/CD］.中华移植杂志：电子版,,14(6)：-.
摘要目的探讨YTHDF1单核苷酸多态性（SNP）在符合杭州标准肝移植受者术后肝癌复发中的预测价值。方法回顾性分析年1月1日至年5月31日在浙江大医院接受肝癌肝移植并符合杭州标准的例受者临床资料，中位年龄54岁（30~73岁），其中男性例，女性19例。在GenmoesProject数据库中，设定人群为汉族、最小等位基因频率5%及r20.8，利用Haploview软件筛选出标签单核苷酸多态性（tagSNP）。采用配对样本Wilcoxon检验比较YTHDF1在肝癌及癌旁组织中的表达差异，采用Kaplan-Meier方法绘制rsG携带型和非携带型肝癌肝移植受者术后无复发生存曲线并比较无复发生存时间，采用Cox比例风险回归模型进行肝癌肝移植术后肿瘤复发影响因素分析，采用卡方检验或Fisher确切概率法比较肿瘤复发与未复发组受者YTHDF1tagSNP基因型分布。P＜0.05为差异有统计学意义。结果随访至年5月31日，例肝癌肝移植受者平均无复发生存时间为（43.9±2.0）个月（1~56个月），其中28例肝癌复发。YTHDF1在肝癌组织中的表达水平高于癌旁组织，评分中位数分别为6分（4~9分）和3分（1~6分），差异有统计学意义（Z=4.，P＜0.05）。28例复发组受者rs位点的G/A型、G/G型和A/A型分别为8、13和7例，例未复发组受者中则分别为42、61和8例，两组基因型分布差异有统计学意义（χ2=0.，P0.05）。其余tagSNP基因型分布差异均无统计学意义（P均0.05）。rsG非携带型（位点为A/A型）受者肝癌复发比例高于携带型（位点为G/A型、G/G型），分别为46.7%（7/15）和16.9%（21/），差异有统计学意义（P=0.）。rsG携带型与非携带型受者术后1年无复发生存比例分别为87.1%（/）和66.7%（10/15），无复发生存时间分别为（45.6±2.1）和（27.9±5.2）个月，差异有统计学意义（χ2=5.，P=0.）。复发组术前AFP≤μg/L和rsG携带型受者比例分别为71.4%（20/28）、75.0%（21/28），均低于未复发组受者［91.0%（/）、92.8（/）］，差异均有统计学意义（χ2=5.和5.，P均0.05）。其余指标差异均无统计学有意义（P均0.05）。将单因素分析中P0.10的变量纳入Cox比例风险回归模型进行多因素分析。结果显示，术前AFP、肿瘤数量、组织学分级和rsG携带与否与肿瘤复发有关（RR=5.、2.、2.和3.，P均0.05）。结论在符合杭州标准的肝癌肝移植受者中，rsG非携带型受者肿瘤复发风险较高。rs基因型对肝移植术后肝癌复发的预测具有潜在价值。
肝细胞癌；肝移植；单核苷酸多态性；杭州标准；YTHDF1
目前肝细胞肝癌（以下简称肝癌）患者肝移植远期疗效优于综合治疗，但术后5年总体生存率仅60%～70%，术后肝癌复发是导致肝移植受者死亡的主要原因之一。因此，快速、简洁预测肝癌肝移植术后复发转移的监测指标对于指导受者术后复查和治疗以及改善长期生存率具有重要意义。浙江大医院肝移植中心通过肝癌肝移植受者大样本的基础和临床研究，筛选影响肿瘤生物学特性的候选参数，提出了首个纳入生物学指标甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）的肝癌肝移植受者选择标准——杭州标准。
研究表明，YTHDF1在调控肝癌细胞周期进程和代谢中起着重要作用，可作为反映肝癌恶性程度和判断预后的生物学指标，但YTHDF1在肝移植后肝癌复发中的作用目前尚不明确。单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，通过影响基因或蛋白质功能参与调控肿瘤的发生发展。国内外多项研究成功构建以SNP为生物学标记物的疾病预后预测模型。
本研究通过分析浙江大医院符合杭州标准的肝癌肝移植受者YTHDF1的SNP基因型，探讨YTHDF1基因多态性对符合杭州标准肝移植术后肝癌复发的预测价值，现报道如下。
1资料与方法
1.1研究对象
年1月1日至年5月31日本院共行肝移植例。纳入标准：（1）病理检查确诊为肝癌；（2）符合杭州标准；（3）随访时间1年。排除标准：（1）围手术期死亡；（2）术前未留存外周血或肝癌周围组织样本缺失。最终纳入例公民逝世后器官捐献肝移植受者，中位年龄54岁（30~73岁），均为汉族，其中男性例，女性19例。HBV感染例，HCV感染2例，意外癌3例，非病*感染、非意外癌6例。90例受者接受了术前治疗，分别为：经导管动脉栓塞化疗56例，肝癌切除史40例，经导管动脉栓塞化疗+肝癌切除史15例，射频导管消融术27例，肝癌切除史+射频导管消融术6例。术后常规采用以环孢素或他克莫司为主的免疫抑制方案，定期随访。所有受者均签署知情同意书，医院伦理委员会审核通过。
1.2分组和观察指标
（1）采用随机数字表法从例受者中选取20例，分析YTHDF1在肝癌及癌旁组织中的表达差异。（2）根据肝移植术后受者AFP水平并结合增强CT、MRI等影像学表现判断肿瘤是否复发，将例受者分为肿瘤复发组与未复发组，比较两组受者SNP基因型分布差异。（3）将例受者分为rsG携带型组和非携带型组，比较两组受者肝移植术后肝癌复发差异。
1.3实验方法
1.3.1YTHDF1在组织中的表达
肝癌及癌旁组织石蜡切片脱蜡至水，用柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）加热修复抗原，放入3%过氧化氢溶液中室温孵育，再用BSA封闭，加YTHDF1抗体（-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司，1∶稀释）4℃孵育过夜，加二抗室温孵育，二氨基联苯胺显色，苏木素复染细胞核，脱水封片，显微镜（XSP-C，北京中航讯科技股份有限公司）镜检。
由本院两位病理科副主任医师独立阅片并进行半定量结果判定。免疫组化染色无棕*色为0分，淡棕*色为1分，棕*色为2分，棕褐色为3分。同一物镜下观察阳性细胞数，无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，＞50%为3分。将染色深度和阳性细胞百分比的得分相乘，5分以上为阳性。
1.3.2YTHDF1基因型检测
（1）标签单核苷酸多态性（tagsinglenucleotidepolymorphism，tagSNP）挑选在GenmoesProject数据库中，设定人群为汉族、最小等位基因频率5%及r20.8，利用Haploview软件筛选出tagSNP。
（2）DNA提取利用QuickGeneDNA全血抽提试剂盒（日本FUJIFILM公司）提取全血基因组DNA，利用组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾莱德生物技术有限公司）提取癌旁组织细胞基因组DNA。
（3）YTHDF1基因型检测利用iMLDRTM多重SNP分型试剂盒（上海天昊技术有限公司）对例样本的YTHDF1SNP进行分型。YTHDF1共有8个tagSNP，其中4个位于基因间隔区（rs、rs、rs和rs），3个位于内含子（rs、rs和rs），1个位于外显子（rs6122）。使用ABIXL测序仪（美国应用生物系统公司）测序，并用GeneMapper4.0分析原始数据。
1.4统计学方法
使用SPSS21.0统计软件进行数据处理。正态分布计量资料以均数±标准差表示，非正态分布计量资料以中位数表示，采用配对样本Wilcoxon检验比较YTHDF1在肝癌及癌旁组织中的表达差异，采用Kaplan-Meier方法绘制rsG携带型和非携带型肝癌肝移植受者术后无复发生存曲线并比较无复发生存时间，采用Cox比例风险回归模型进行肝癌肝移植术后肿瘤复发影响因素分析。计数资料以百分数表示，采用卡方检验或Fisher确切概率法比较肿瘤复发与未复发组受者YTHDF1tagSNP基因型分布。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
随访至年5月31日，例肝癌肝移植受者平均无复发生存时间为（43.9±2.0）个月（1~56个月），28例肝癌复发。25例死亡，死因分别为：移植肝衰竭1例，腹腔内出血2例，脓*血症1例，多器官功能衰竭1例，呼吸系统和神经系统并发症各1例，肝癌复发18例。11例术后发生排斥反应的受者中，3例因肝癌复发死亡，1例因腹腔内出血死亡，7例治疗后好转。rsG非携带型15例，携带型例。
2.1YTHDF1在肝癌及癌旁组织中的表达水平
YTHDF1在肝癌及癌旁组织中均有表达，其阳性染色呈棕*色弥漫染色或颗粒状主要分布在细胞质，细胞核无表达。YTHDF1在肝癌组织中的表达水平高于癌旁组织，评分中位数分别为6分（4~9分）和3分（1~6分），差异有统计学意义（Z=4.，P＜0.05）。
2.2YTHDF1基因型与肝癌肝移植术后肿瘤复发的关系
28例复发组受者rs位点的G/A型、G/G型和A/A型分别为8、13和7例，例未复发组受者中则分别为42、61和8例，两组基因型分布差异有统计学意义（χ2=0.，P0.05）。其余tagSNP基因型分布差异均无统计学意义（P均0.05）。详见表1。
rsG非携带型（位点为A/A型）受者肝癌复发比例高于携带型（位点为G/A型、G/G型），分别为46.7%（7/15）和16.9%（21/），差异有统计学意义（P=0.）。rsG携带型与非携带型受者术后1年无复发生存比例分别为87.1%（/）和66.7%（10/15），无复发生存时间分别为（45.6±2.1）和（27.9±5.2）个月，差异有统计学意义（χ2=5.，P=0.）。生存曲线见图1。
2.3肝癌肝移植术后肿瘤复发影响因素分析
复发组术前AFP≤μg/L和rsG携带型的受者比例分别为71.4%（20/28）、75.0%（21/28），均低于未复发组受者［91.0%（/）、92.8（/）］，差异均有统计学意义（χ2=5.和5.，P均0.05）。其余指标差异均无统计学意义（P均0.05）。详见表2。
将单因素分析中P0.10的变量纳入Cox比例风险回归模型进行多因素分析。结果显示，术前AFP、肿瘤数量、组织学分级和rsG携带与否与肿瘤复发有关（RR=5.、2.、2.和3，P均0.05）。详见表3。
3讨论
N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）是真核生物mRNA最常见的转录修饰，在调控mRNA稳定性、剪切和翻译方面具有重要作用。YTHDF1作为m6A的结合蛋白之一，通过调节不同信号通路在肿瘤发生、发展及复发中起作用。YTHDF1表达上调及功能增强，与肿瘤的生物学侵袭性及不良预后相关。YTHDF1基因敲除小鼠研究表明，YTHDF1识别经m6A修饰后的编码溶酶体蛋白酶的转录物，使细胞*性T细胞无法识别癌细胞，最终导致肿瘤的免疫逃逸。研究发现，YTHDF1高表达的肝癌患者肝癌切除术后无复发时间缩短、疾病进展加快。本研究中符合杭州标准肝癌肝移植受者肝癌组织中YTHDF1表达水平高于癌旁组织。
已有研究证实，VEGF、HDACs、GPI和IL10基因的SNP与肝癌肝移植术后转移复发显著相关。因此，将YTHDF1的SNP运用于预测肝癌肝移植术后肿瘤复发的研究具有可行性及现实意义。本研究发现，位于外显子上的rs6122基因型与肝癌肝移植术后肿瘤复发不相关。这可能是由于该位点的SNP导致相关位点编码甘氨酸的碱基发生转换，即GCC突变为GCT，但仍旧编码甘氨酸，属于编码区同义SNP，即碱基序列的改变不影响蛋白质氨基酸序列，蛋白质功能不受影响。因此，该位点SNP不影响YTHDF1的表达。我们发现位于基因间隔区的rs基因型与肝癌肝移植术后肿瘤复发相关，这说明SNP不仅仅通过编码蛋白的氨基酸序列变化一种方式去影响基因或蛋白质功能。既往研究发现，通过外显子跳跃、远近端启动子及内含增强子变异等方式，导致基因表达、mRNA稳定性或蛋白质结构发生改变，从而影响YTHDF1的功能。
本研究发现rsG携带型肝癌肝移植受者无复发生存率高于G非携带型，分别为46.7%和16.9%，差异有统计学意义（P=0.）。Cox比例风险回归模型多因素分析结果显示，术前AFP、肿瘤数量、组织学分级和rsG携带与否与肿瘤复发有关（P均0.05）。
本研究首次发现YTHDF1的SNP与符合杭州标准的肝癌肝移植受者术后肿瘤复发风险相关，有望成为肝癌肝移植术后肿瘤复发预测指标，指导高复发风险肝癌肝移植受者缩短复查间隔，提前发现并干预新发病灶，延长生存时间。本研究也具有一定局限性：（1）研究对象为符合杭州标准中国汉族肝癌肝移植受者，且多为HBV携带者（/），本研究结论是否适用于杭州标准外、其他种群及其他肝病背景的受者有待证实；（2）本研究仅针对受者相关临床指标展开分析，未考虑供者基因方面的影响。但我们希望以此作为系统研究的起点，通过扩大样本的前瞻性研究，探索将YTHDF1基因多态性用于预测肝癌肝移植受者术后肝癌复发的可操作性。
综上所述，我们首次发现了符合杭州标准的肝癌肝移植受者术后肿瘤复发的风险差异与YTHDF1的遗传多态性密切相关，检测符合杭州标准的肝癌肝移植受者YTHDF1基因多态性对预测术后肝癌复发具有重要参考价值。
参考文献（略）
通信作者：郑树森（浙江大医院肝胆胰外科）预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇