摘要：目的应用代谢组学技术，探究蒙古扁桃石油醚提取物对肝纤维化病程中代谢轮廓及生物标志物的影响，从代谢角度揭示其抗肝纤维化的作用机制。方法大鼠连续8周sc四氯化碳（CCl4）建立肝纤维化模型，同时ig蒙古扁桃石油醚提取物（1.75、1.25、0.75g/kg）或水飞蓟素（50mg/kg）。采用超高效液相色谱与四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF/MS）联用技术，分析各组大鼠给药后第2、4、6、8周血清代谢表达谱的动态变化，比较不同时间的大鼠血清潜在生物标志物含量变化，依据代谢通路分析构建药物-靶点-通路网络图。结果蒙古扁桃石油醚提取物可纠正CCl4诱导的肝纤维化疾病发展各阶段代谢谱，实验第2周时未见其对肝纤维化早期关键生物标志物产生回调；中期（第4周）主要通过作用于胆固醇和鞘磷脂，减轻肝损伤，延缓肝纤维化形成；晚期（第8周）主要通过回调鞘氨醇、鞘磷脂、胆固醇等8个关键生物标志物水平，参与鞘脂类、甘油磷脂代谢，初级胆汁酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成与降解，发挥抗纤维化作用；蒙古扁桃石油醚提取物中剂量（1.25g/kg）对代谢谱回调趋势更明显，对差异代谢物及关键生物标志物回调数量较多，抗肝纤维化效果较佳。结论基于UPLC-MS代谢组学技术从微观代谢角度揭示了蒙古扁桃石油醚提取物可通过多靶点影响肝纤维化代谢物水平及其相关代谢通路，从而有效改善肝纤维化。
肝纤维化是炎症等刺激器官，实质细胞发生坏死、组织内细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）异常增多和过度沉积的复杂动态可逆性病理过程[1]。中药具有多环节、多途径、多靶点的作用特点，在治疗脏器纤维化方面有独特优势。因此，挖掘天然有效药物，对治疗肝纤维化有重要意义。代谢组学技术在方法学上具有集融整性、动态、综合、分析于一体的特点，与中医药整体观相吻合，广泛应用于中医药疗效评价与机制研究[2-4]。
蒙古扁桃Amygdalusmongolica(Maxim.)Ricker蒙名为乌兰-布衣勒斯，是蒙古高原特有的阿拉善荒漠种，属蔷薇科扁桃属旱生落叶灌木[5]。蒙古扁桃作为民间传统药材，其种仁代替中药“郁李仁”入药，性平、味苦，能润燥滑肠、止咳化痰、利尿，主治咽喉干燥、干咳、支气管炎、阴虚便秘、水肿等症[6-7]。课题组前期对蒙古扁桃化学成分和药理作用进行了基础研究，从其种仁中分离发现不饱和脂肪酸、苦杏仁苷、有机酸、*酮类、多糖类、生物碱类等多种成分[8-13]。蒙古扁桃石油醚提取物作为其有效组分被证实具有良好的调血脂、抗脂质过氧化、改善肝肾纤维化作用[14-16]。由于肝纤维化的发生发展为动态进展式病程，因此研究疾病不同阶段的生物标志物动态变化对药物的药效评价及机制研究具有重要意义。目前尚缺乏蒙古扁桃石油醚提取物对肝纤维疾病发展的动态研究，且其潜在作用机制不明。
课题组前期通过病理组织、氧化指标、血清肝纤维化四项对蒙古扁桃石油醚提取物进行了药效学评价，并初步证实其具有抗肝纤维化作用[15]。本研究在此基础上，运用代谢组学技术，探究其对肝纤维化模型大鼠不同阶段血清代谢谱、潜在生物标志物的种类和含量的影响，进一步从代谢角度揭示蒙古扁桃提取物抗肝纤维化的作用机制，为寻找抗肝纤维化的有效药物提供科学依据，也为蒙古扁桃药理作用的深入研究和中蒙药资源的开发提供理论基础和实验指导。
1材料
1.1药物
蒙古扁桃药材采自阿拉善雅布来戈壁，经包头医学院药学院石松利教授鉴定为蔷薇科桃属扁桃亚属植物蒙古扁桃A.mongolica(Maxim.)Ricker的干燥成熟种子；水飞蓟素胶囊（批号，规格14mg/粒）购自德国马博士大药厂。
1.2试剂
四氯化碳（carbontetrachloride，CCl4，批号）购自天津市北方天医化学试剂厂；特级初榨橄榄油（批号）购自山东鲁花集团有限公司；羧甲基纤维素钠（批号）购自天津市凯通化学试剂有限公司；乙腈（色谱级）购自美国ThermoFisherScientific公司；亮氨酸脑啡肽购自美国Sigma-Aldrich公司；纯净水购自美国Sigma公司；甲酸（色谱级）购自美国DikmaTechnologies公司。
1.3动物
SPF级SD雄性大鼠，4周龄，体质量～g，48只，购自北京大学医学部（实验动物科学部），许可证号SCXK（京）-。饲养条件：实验室温度23～25℃，相对湿度（50±5）%。动物实验已获得内蒙古科技大学包头医学院医学伦理委员会批准（批准号）。大鼠最终采取sc水合氯醛麻醉处死。
1.4仪器
DZW-8-8型水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；RE-52A型旋转蒸发仪、SHZ-D（III）循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；TGL-16M型高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；MH-型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；AcquityTMUPLC超高液相色谱仪、四极杆-飞行时间串联质谱仪（Q-TOF/MS，美国Waters公司）；KDC-HR高速冷冻离心机（科大创新有限公司）。
2方法
2.1蒙古扁桃石油醚提取物的制备
取蒙古扁桃种仁，碾碎后用回流煎煮法以95%乙醇90℃提取2次，70%乙醇90℃提取1次，每次2h，回收溶剂浓缩成稠浸膏制备总提物，再用石油醚进行萃取，浓缩挥干称重，得石油醚萃取物，得率为13.7%。经成分含量分析，蒙古扁桃石油醚提取物主要含脂肪酸类化合物，其中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的73.20%，主要包括28.87%油酸、38.69%亚油酸；饱和脂肪酸以棕榈酸为主，其质量分数为19.66%[14]。
2.2肝纤维化模型制备、分组和给药
大鼠肝纤维化模型制备方法参照文献方法[17]，依据石油醚提取物有效剂量，大鼠适应1周后，按体质量随机分为对照组，模型组，水飞蓟素（50mg/kg，水飞蓟素溶于0.5%羧甲基纤维素钠配制成质量浓度为10mg/mL的溶液）组，蒙古扁桃高、中、低剂量（1.75、1.25、0.75g/kg，蒙古扁桃石油醚提取物溶于0.5%羧甲基纤维素钠分别配制成质量浓度为0.35、0.25、0.15mg/mL的溶液）组，每组8只[14-15]。除对照组大鼠sc橄榄油外，其余各组大鼠于腹部sc40%CCl4橄榄油溶液（首次5mL/kg，之后3mL/kg），2次/周，持续8周。造模同时各给药组大鼠ig相应药物（5mL/kg），模型组和对照组ig等体积羧甲基纤维素钠溶液。
2.3样本收集
大鼠分别于实验第2、4、6、8周眼眶静脉取血，置于分离胶促凝管中，离心取上清，于?80℃保存，用于血清代谢组学研究。
2.4血清代谢组学研究
2.4.1色谱条件AcquityUPLCBEHC18色谱柱（mm×2.1mm，1.7μm）；流动相A为0.1%甲酸乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～15min，2%～%A；15～17min，%A；17～18min，%～2%A；18～20min，2%A；柱温为40℃；体积流量为0.4mL/min；进样量为2μL。
2.4.2质谱条件电喷雾离子源（ESI），采用正、负离子W模式检测，毛细管电压为V（ESI＋）、V（ESI?）；样品锥孔电压为60V（ESI＋）、70（ESI?）；离子源温度为℃；脱溶剂温度为℃；脱溶剂氮气体积流量为L/h；锥孔气体积流量为20L/h。锁定质量溶液，采用美国Waters公司LockSprayTM校正系统进行在线质量校正。亮氨酸脑啡肽准分子离子峰为[M＋H]＋＝.、[M－H]?＝.，锁定质量浓度为1ng/mL，体积流量为30μL/min。扫描方式为全扫描，质量扫描范围为m/z:～。
2.4.3多元数据分析将各组血清样品测得的质谱数据导入WatersProgenesisQI2.3软件进行分析。每个离子的强度相对于总离子数进行归一化，并生成数据矩阵，包括保留时间、质荷比、归一化后的峰面积。再使用WatersEZinfo3.0软件，采用无监督的主成分分析法（principal